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如何应对ELISA基质效应?

这个坑,别栽了!如何应对ELISA基质效应?

原创 2017-04-14 R&D Systems

2001年6月,美国曾爆出过一个大新闻:因为临床诊断中,hCG 免疫检测试剂盒得到了假阳性结果,使一位名叫Jennifer Rufer的女性被误诊为癌症,因此经历了长期化疗、肺部手术、甚至子宫切除。当事人把医院和诊断试剂公司告上法庭,获得了1620万美元的赔偿,创下当时医疗事故的最高赔偿金额。


胜诉后的Jennifer Rufer


痛苦的遭遇,巨额的赔偿,就因一个hCG检测假阳性结果而起,这太坑了!法院把责任判给了诊断试剂公司和医院,但这事的始作俑者其实是一种被称为“基质效应”的免疫检测干扰现象。


基质效应


基质是指样品中目标分析物以外的部分,由于基质成分会对分析过程有显著干扰,影响分析结果的准确性。业内把这些影响统称为基质效应(Matrix Effects)。这是免疫检测方法开发和使用中需要避开的大坑。


Jennifer Rufer事件就是一个典型的基质效应造成假阳性的案例。该hCG试剂盒用的抗体是鼠源的,业界观点认为部分人群血液含有抗鼠抗体(HAMA),它们对鼠源的捕获抗体和检测抗体都有高亲和力,会造成基质效应,导致了假阳性。


如何评估基质效应


基质效应的原因错综复杂,但不用担心,有两种简单的方法可以用来评估基质效应。


1. 线性稀释:


一般来讲,抗原和捕获/检测抗体之间的结合作用很强,样品浓度被稀释并不影响它们的结合,而造成基质效应的非特异结合的力要弱很多,如果不断稀释样品,非特异结合造成的干扰会逐步减少,测量值也更接近真实值。没有基质效应时,无论如何稀释,测量值都和真实值吻合。而有基质效应时,稀释会造成非特异性结合比例的减少,测量值也相应地产生很大改变:




前文提到,基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种,在线性稀释时就可以辨别出来。下图是两组实测的ELISA产品线性稀释的对比结果,不同品牌的ELISA 试剂盒表现差距非常大:





图中的纵坐标代表的是回收率。定义用原液直接检测的值为100%,不同稀释比下的测量值先乘上稀释比换算出浓度,再除以原液直接检测的值,比值的百分数,就是回收率。


左图的黄色线,和右图的红色线,曲线平直,回收率稳定在90-110%,很好地控制了基质效应的干扰。左图的紫色线,回收率随线性稀释严重偏离100%,说明存在显著的基质效应;而回收率升高的趋势,说明稀释前的真实浓度被压低,对应基质效应是假阴性。右图的绿色线也严重偏离100%,但回收率随稀释降低,于左图紫色线正好相反,属于明显的假阳性基质效应。


2. 掺入/回收率实验(Spike/Recovery Assay)


基质效应还可以通过分析物的掺入/回收率实验发现,将低、中和高浓度的分析物掺入到已测定过浓度的样本中,掺入前后实测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率,回收率以百分比的形式呈现。回收率介于80-120%,才符合标准。



R&D Systems 让您免受基质效应折磨


基质效应可以通过产品研发阶段的优化尽可能去消除的。在ELISA试剂盒领域,R&D Systems是行业金标准,产品是高品质的代名词,其中一个质量控制指标就是针对基质效应的产品优化:


1. 量身定制的缓冲液系统


优化缓冲液是消除基质效应的重要一环,R&D Systems进行ELISA试剂盒研发时,资深专家们会根据产品类型进行系统的缓冲液优化,为每种分析物量身定制最佳的缓冲液组合:



Quantikine ELISA Kit包含多种缓冲液,主要是Assay Diluent和Calibrator Diluent两种稀释液,对于差异较大的样本,如细胞上清对比血清/血浆,会有专门的稀释液分别对应。这些优化后的缓冲液体系能很好消除基质效应。


2. 排除交叉反应

当检测某个分析物时,其他相关因子或类似结构因子如果有非特异性结合,也会导致基质效应。为此,R&D Systems在Quantikine ELISA Kit研发时会进行详尽的交叉反应测试:用相关因子单独测试有无非特异性结合,将相关因子和分析物同时测试看是否存在干扰。


R&D Systems进行大量优化,确保没有明显的交叉反应和干扰,通过验证的相关因子都记录在Quantikine ELISA Kit的说明书中,供您参考:




3. 严格的基质效应测试

R&DSystems 生产的所有Quantikine ELISA Kit,都必须通过严格的基质效应测试,包括线性稀释和掺入/回收率实验,并把测试结果记录在说明书中:


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