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ELISA实验常见问题解决方案

问题

序号

可能原因

解决方法

显色淡,灵敏度偏低

1

 试剂盒未充分平衡

试剂盒从2~8℃冰箱取出后打开盒盖,于室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温(约25℃)

2

 样品不适合做ELISA检测

样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件(例如稀释液的成分)

3

 酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥

防止板过于干燥

4

 包被抗体遭到破坏

操作温和,移液枪不能碰到孔底

5

 样本和抗体孵育条件不合适

按照说明书条件,建议孵育过程中全程振荡孵育。

6

 洗涤浸泡时间过长

按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间;

7

 偶联HRP试剂污染

弃去试剂,重新配置

8

 错误的稀释偶联HRP试剂

弃去试剂,重新配置

9

 TMB底物孵育时间过短,因非人为因素影响,需要优化孵育时间

确定合适的孵育时间:人为判定-最高浓度的标准品出现深蓝色;S4-5有淡蓝色;机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65

10

 样本浓度过高或存在基质效应

建议做不同稀释倍数,确认样本最佳稀释倍数。

11

 酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对

确认仪器设置及选择正确的波长检测。

12

 酶标板不适合做ELISA

不能使用细胞培养板,建议使用ELISA专用高吸附力板子。

背景深,全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)

1

 洗涤不充分,洗后未拍干,样品中其它成分残留或酶标记物残留

洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用,不要反复使用,否则易造成污染。

2

 底物污染,未避光保存,出现颜色

弃去底物,重新配置

3

 样品稀释液污染

弃去稀释液,重新配置

4

 吸头重复使用,未洗净或消毒不彻底

吸头尽可能一次性使用

5

 不正确的孵育时间,温度(尤其是底物孵育的时间)

最为常用的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃。完全按照说明书要求。

6

 偶联抗体(streptavidin-HRP)浓度过高

按照说明书调整到最佳的浓度

7

 ELISA板子不正确的贮存

酶标板贮存于2-8 ℃;使用结合力低点的Elisa板

8

 没有正确封闭

在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间

9

 样本溶血严重

建议使用非溶血或轻微溶血样本,严重溶血样本会导致背景偏高。

重复性不佳,高CV值

1

 样品不均一

加样前充分混匀样品,取样确保移液位置一致;

2

 包被板表面遭到破坏

洗板加样时尽量小心,避免破坏板的包被表面

3

 孔与孔之间的交叉污染

孵育后取下盖子小心操作,避免孔与孔的污染;封板膜不能重复使用

4

 加样量不一致

样品稀释前应充分混匀,尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴

5

 边缘效应(外周孔显色较中心孔深)

孵育时尽量100 rpm旋转混匀

6

 微量加样不准确

保证微量加样的准确性和均一性

7

 不正确的洗涤

洗液准确配制;充分洗涤,静置15秒,确定每一步的洗涤

出现白板,阳性对照不显色

1

 显色液变质

更换新的显色液

2

 洗涤液配制有误

请按说明书所示稀释倍数配制

3

 未加酶结合物而认为已加入

注意不要漏加

4

 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用

每次加液前均应看清标签

5

 标准品稀释方法错误/或标准品有问题

请按照说明书所示配置说明书,注意单位和稀释倍数

6

 不同试剂盒或不同批号的试剂混用

建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

不正常的标准曲线

1

 错误的方法重悬标准品

 加入正确量的溶液重悬标准品,重悬充分

2

 标准品稀释错误

 按照说明书要求稀释标准品

3

 标准品污染

 使用一次性的灭菌吸头, 标准品贮存于2-8 ℃

4

 错误的倍比稀释步骤

 按照说明书倍比稀释标准品

5

 波长选择错误

TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用,而 前者比色波长为450nm,后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。

6

 标准品混用

 不同批号试剂勿混用

7

 试剂盒在运输途中时间太长,温度太高,标准品失活

 尽量缩短运输时间,夏季应放冰块降温

8

 ELISA未终止而直接检测450nm和620nm

TMB显色需终止后检测,否则会出现620nm比450nm读数高的现象。(数值仍有梯度规律)

样品或标准品OD超出正常范围

1

 错误的样品或标准品的稀释

 完全按照说明书稀释

2

 偶联抗体浓度过高

 按照说明书调整到最佳的浓度

3

 TMB底物孵育时间过长

 调整到合适的孵育时间

4

 样品或标准品污染

 避免污染

5

 错误的孵育时间或温度

 完全按照说明书

6

 孵育时未加盖导致溶液挥发和污染

 贴封片或加盖

标曲很好,但是样本无法计算到数值

1

 标曲选择不合适

选择最合适的标曲拟合;

2

 样本含量很低,低于灵敏度无法被检测到

尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测

3

样本含量很高,超过标曲

建议进行预实验摸索稀释倍数,确保样本OD值落在标曲范围内

标曲高浓度间无明显趋势

1

如OD绝对值靠谱,但是仅无梯度,则显色过度

TMB显色体系中建议根据S1,S2颜色进行判断,当S1,S2深蓝色,有明显梯度,S5有淡蓝色时即可终止。

2

仅作单波长检测。

由于参考波长读取非特异性检测,如指纹、划痕、水渍等,对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。


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