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新研制的一个体外诊断试剂,有多难

生物标志物,至今还没有一个非常明确的定义,权威的定义是NIH1998年的定义:a characteristic that is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biologic processes, pathogenic processes, or pharmacologic responses to a therapeutic intervention

肿瘤标志物是生物标志物中的一类,可以是蛋白质、DNARNA,我们以蛋白质肿瘤标志物为例,先看一组数据,在美国,以最近十年的数据,平均1.5年,有一种新的肿瘤标志物检测技术被FDA批准,而这些蛋白肿瘤标志物,绝大多数是基于免疫学反应来检测的(ELISA和免疫组化)。

一个蛋白肿瘤标志物,从发现到临床实际应用,要经历哪些?在Pubmed上文献检索显示,用肿瘤标志物做为关键词,有230000篇文献,最后FDA批准了23种临床应用的蛋白类肿瘤标志物,等于10000篇论文,转化1个蛋白类肿瘤标志物。

以上的三段文字,摘录至王守业总的科学网博客。这些基础研究工作,一般要经历数十年,采用各种方法学,进行“定性”式的研究,发现某个蛋白具有“潜在”临床应用价值,这个过程漫长且艰辛,我们只能对于研究者献上崇高敬意,暂且不论这个过程。我们以一个被明确定位有潜力做为蛋白类肿瘤标志物,以最常用的双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)为例,看开发一个可以应用于临床(可以是早筛、伴随诊断、药物评估、预后等用途)的检测方法,是一个什么样的过程。

酶联免疫法的基础是抗体,理论上应用两株与抗原不同表位反应的抗体,在没有空间位阻情况下,可以形成固相抗体-抗原-酶标抗体的“三明治”免疫复合物,由此依据校准品浓度和吸光度,对未知抗原浓度进行定量检测。要完成这种检测方法的开发,必须满足五个条件:

1、抗体是特异性的。

2、两株抗体结合抗原的时候,是没有空间位阻的。

3、两株抗体都是针对抗原的主流位点,不会产生漏检。

4、合适的检测体系。

5、合适的临床试验方案

以单克隆抗体制备为例,要用到免疫原和筛选原,对一个新发现的抗原,很难进行提取纯化天然抗原的,一般是先通过基因工程技术,制备重组蛋白,免疫小鼠,通过细胞工程手段,获得杂交瘤,生产单克隆抗体。再研发检测试剂盒,进行临床试验,确认可用于的临床应用。这个技术路线是非常成熟,甚至是在生命科学领域,国内与国际差距最小的一个技术。

一个试剂盒,满足体外诊断要求的话,一般有两个主要指标:特异性和敏感性。简单地说,一定要区别“疾病”和“正常”,并且,在疾病发生前,越早出现越好,在疾病恢复后,越早消失越好,在疾病发展进程中,随病情变化越相关越好,由此贯穿疾病的早期筛查、疗效评价、预后等各个环节。但是,一般很难有如此优秀的标志物,能实现某一应用,就非常不错。

我们不去展开这其中的细节,归结为两点:试剂盒研发和临床试验验证。我们分为模仿性体外诊断试剂开发和新研制体外诊断试剂开发两类,分别简单分析一下。

模仿性体外诊断试剂开发比较容易理解,我们90%以上的体外诊断试剂研发人员,是在从事这个工作,筛选原料、调整配方、建立体系,最终的一个目的:与已有上市的同品种,同时双盲测试一定数量的符合要求的临床样本,检测结果具有很好的相关性、很高的符合率,满足上市要求。用指导原则的原话说:“采用试验用体外诊断试剂与已上市产品,针对临床样本进行比较研究试验,证明试验用体外诊断试剂与已上市产品等效。”

做过模仿性体外诊断试剂开发的人员都知道,一个诊断试剂盒,要符合申报上市的要求,原材料占70%、工艺占20%、思路占10%。(这个在我们微信公众号平台:abbestab,有详细论述)。所以模仿性开发,一般是先大范围筛选原料,获得初步可行的候选原料,进入后续的工艺开发,配方调整,直至性能符合申报上市的要求。这个过程,不用考虑受试者情况,只是做一个跟比对试剂相关性的研究,比较简单,可以说,只要有合适原料,做一个产品不难(当然,做卓越的产品另论)。这是在“待测物”浓度水平的一个研究。

新研制体外诊断试剂开发,试剂盒开发工作跟上面相同,在临床试验不同。确认“金标准”,用“金标准”确定疾病组、对照组的受试者入组要求。采用双盲法同步检测,计算试验用体外诊断试剂检测结果与“金标准”判断结果符合或者差异程度的统计学指标,然后进行评价。

新研制的体外诊断试剂开发,要花大量时间在疾病组、正常组的金标准确认,受试者的入组登记、治疗随访、跟踪研究,这只是一个疾病层面,受试者的检测体液内,没有一个明确的“待测物”浓度水平。不同病例,如症状典型和非典型的,病程早、中、晚期的,病情轻、中、重型的,不同性别、不同年龄层次,以及相类似的疾病,都会对这个“待测物”产生影响。

新研制的体外诊断试剂,开发过程就很复杂,首先要获得很好的抗原,去制备足够多的抗体,然后应用足够多金标准确证的样本,对抗体进行系统的评价,获得具有临床相关性的候选抗体,再开发成检测试剂,进行初步临床试验,评价试剂效果,再进行后续临床试验,扩大试验样本。这是一个动态、不断修正,甚至推倒重来的过程。

而且,对于每个预期用途的疾病类型,每个应用范围:比如早筛、病情监测、疗效评价、预后等,都要做相应的临床试验,并得到确认可靠的试验结果,才能进行应用。所以,能够将一个潜在生物标志物,成功完成临床应用确证,申报成一个新研制的体外诊断试剂,是非常不容易的过程。许多优秀的生物标志物,比如肌钙蛋白(cTnI)、抗穆勒氏管激素(AMH),都是科学家倾其毕生精力,研究并转化的结果。

因此,一个新研制的体外诊断试剂,都会有比较局限的疾病检查适应症、比较单一的应用范围(早筛、病情监测、疗效评价、预后),随着后续临床试验的深入与扩展,再获得新的适应症和新的应用范围。

开发一个新研制的体外诊断试剂,着实非常不易,相关报道一定要明确适应症和应用范围,相关科室一定要严守适应症和应用范围这条红线,一旦跨越这个界限,就是误导、夸大、滥用、超用。可惜,细究目前的检测项目,这种情况比比皆是。


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