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人胰岛素定量检测试剂盒

人胰岛素定量检测试剂盒(ELISA)说明书

【产品名称】

通用名称:人胰岛素定量检测试剂盒(ELISA

英文名称:Human INS

【包装规格】

96人份/

【预期用途】

仅供科研使用,定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中PRLR的浓度。





【检验原理】

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人//Insulin 单克隆抗体预包

被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体,经过孵育,

样本中存在的Insulin 与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后,加入辣根过氧化物

酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)。洗涤后,加入显色底物TMB,避光显色。颜色反应的深

浅与样本中Insulin 的浓度成正比。加入终止液终止反应,在450 nm 波长(参考波长570 - 630 nm)

测定吸光度值。【主要组成成分】

主要成分

组分

规格

数量

包被微孔板

96T

1

标准品

500pg/mL

2

抗体

80uL

1

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素

150uL

1

10×检测缓冲液

5mL

1

标准品稀释液

5mL

1

TMB显色液

10mL

1

TMB终止液

10mL

1

洗涤缓冲液(20X)

30ml

1

封板膜


4

注意:使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致

【样本要求】

  样本类型和采集

细胞培养上清

 300 g 离心 10 分钟去除沉淀物,即刻检测或者分装,-20℃以下贮存。

血清样本

分离管分离血清。在 1000 g 离心之前,使血样凝集 30 分钟。吸取血清样本之后即刻检测,或 者分装,-20℃以下贮存。

血浆样本

EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1000 g 离心 3 0 分钟收集样本。即刻检测,或者 分装,-20℃以下贮存。 本试剂盒可能适用于其它生物学样本。

细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。

 

注意:检测前,样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。 样本应分装并贮存于-20℃,以避免人IL-6活性的丢失。如果在 24 小时内检测,样本可以 存放在 2 - 8℃。 避免样本的反复冻融。在检测前,冷冻样本应该缓慢地恢复至室温,轻柔地混匀。

样本保存和稳定性

样本在2-8℃条件下,可以储存72h,或者在- 20℃储存6个月。样本收集后,不是一次检测完,请按一次用量分装冻存,避免反复冻融,使用时在室温下解冻,确保样品均匀充分解冻。

【检验方法】

试剂准备

检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温。 如果浓缩的试剂出现结晶,37℃温浴,直至结晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×浓缩洗液 30 ml  1 L 的量筒,加蒸馏水或去离子水至600 ml,轻轻混匀,避免泡 沫。 转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存,1×洗液可稳定 30 天。

1×检测缓冲液

 吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml  100 ml 量筒,加蒸馏水或去离子水至 50 ml,轻轻混匀,避 免泡沫。 2 - 8℃贮存,1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。

检测抗体 稀释前充分混匀。根据标准品和待测样本的数量,用 1×检测缓冲液按 1100 稀释浓缩的检 测抗体。 注意:请在 30 分钟内使用稀释后的检测抗体。

 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素

稀释前充分混匀。 根据标准品和待测样本的数量,用 1×检测缓冲液按 1100 稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的 链霉亲和素。 注意:请在 30 分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

样本稀释

如果样本需要稀释,请用试剂盒提供的 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本,用细胞培养基稀释 细胞培养上清。

人胰岛素标准品

用蒸馏水或去离子水重溶人胰岛素标准品,重溶体积标注在人胰岛素标准品的标签上。轻柔 地涡旋震荡,确保充分混匀,重溶后标准品的浓度为4000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释 前充分混匀。 请使用聚丙烯管进行标准品稀释。

标准曲线制作血清/血浆样本标准曲线的制作:

 250 μ浓缩的人胰岛素标准品,加入 250 μ标准品稀释液,作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μ标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1系列稀释。每次移 液时,请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。

细胞培养上清样本标准曲线的制作:

 250 μ浓缩的人胰岛素标准品,加入 250 μ细胞培养基,作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μ细胞培养基。使用高浓度标准品做 1系列稀释。每次移液 时,确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零

【检测步骤】

检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。

1. 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。

2. 将不需要的板条拆卸下来,放回装有干燥剂的铝箔袋,重新封好封口。

3. 加入300 μl 1×洗液静置浸泡30 秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后,

在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后,请立即使用微孔板,不要让微孔板干燥。

4. 复孔加入100 μl 2 倍倍比稀释的标准品。空白孔复孔加入100 μ标准品稀释液。

5. 样本孔加入50 μl 1×检测缓冲液和50 μ样本。

6. 每孔加入50 μ稀释的检测抗体。保证步骤45连续加样,不要间断。加样过程在15 

钟内完成。

7. 使用封板膜封板。300 /分钟振荡,室温孵育1.5 小时。

8. 弃掉液体,每孔加入300 μ洗液洗板,洗涤次。每次洗板,在吸水纸上拍干。为获得理想的

实验性能,必须彻底移除残留液体。

9. 每孔加入100 μ稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

10. 使用新的封板膜封板。300 /分钟振荡,室温孵育30 分钟。

11. 重复步骤8

12. 每孔加入100 μ显色底物TMB,避光,室温孵育5 - 30 分钟。

13. 每孔加入100 μ终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均

匀,请轻轻叩击板框,充分混匀。

14. 在30 分钟之内,使用酶标仪进行双波长检测,测定450 nm 最大吸收波长和570 nm 630 nm

参考波长下的OD 值。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去570 nm 630 nm 的测定值。

仅使用450 nm 测定会导致OD 值偏高,并且准确度降低。【结果计算】

计算标准品和样本的平均OD 值,然后减去零浓度标准品的OD 值。

以标准品浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。回归分

析确定最佳拟合曲线。通过对浓度值和OD 值取对数拟合,可以对标准曲线进行线性化。此过程

可能可以得到更多样本的浓度,但数据的准确度会降低一些。

注意:标准曲线最高浓度点的终浓度为500 pmol/ml。如果完全按照说明书的步骤操作 (50 μl

样本 + 50 μ检测缓冲液),计算样本浓度时请乘以稀释因子2

如果样本按照说明书进行了稀释,最终的稀释倍数为2。如果样本进行了其它方式的稀释,计

算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。【检验方法的局限性】

1、仅供科研使用,不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的有效期内使用,过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于最高标准品浓度值,请将样本适当稀释后,再重新测定。

6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果,检测前,请排除该因素。

7、通过其他方法得到的检测结果,与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。


【产品性能指标】

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装,无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数r值,大于等于0.9900

3、精密度

批内精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%

批间精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%

4、检测范围

7.81pg/ml→500pg/ml

5、灵敏度

最低检出剂量小于0.35pg/mL。

6、回收率

三组已知的高、中、低浓度样品,进行五次回收率评估,回收率在85%-115%之间。

7、特异性

本试剂盒识别天然和重组人胰岛素,与结构类似物无交叉。

8、稳定性

    2-8℃保存,有效期6个月。


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