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人白细胞介素6 (IL-6)试剂盒

人白细胞介素6 (IL-6)定量检测试剂盒(ELISA)说明书

【产品名称】

通用名称:人白细胞介素6 (IL-6)定量检测试剂盒(ELISA

英文名称:Human IL-6

【包装规格】

96人份/

【预期用途】

仅供科研使用,定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中IL-6的浓度。


【检验原理】

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人IL-6单克隆抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生物素化的检测抗体,经过孵育,样本中存在的IL-6与固相抗体和检测抗体结合。洗涤去除未结合的物质后,加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-HRP)。洗涤后,加入显色底物TMB,避光显色。颜色反应的深浅与样本中IL-6的浓度成正比。加入终止液终止反应,在450 nm波长(参考波长570 -630 nm)测定吸光度值【主要组成成分】

主要成分

组分

规格

数量

包被微孔板

96T

1

标准品

1000pg/mL

2

抗体

80uL

1

辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素

150uL

1

10×检测缓冲液

5mL

1

标准品稀释液

5mL

1

TMB显色液

10mL

1

TMB终止液

10mL

1

洗涤缓冲液(20X)

30ml

1

封板膜


4

注意:使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致

【样本要求】

  样本类型和采集

细胞培养上清

 300 g 离心 10 分钟去除沉淀物,即刻检测或者分装,-20℃以下贮存。

血清样本

分离管分离血清。在 1000 g 离心之前,使血样凝集 30 分钟。吸取血清样本之后即刻检测,或 者分装,-20℃以下贮存。

血浆样本

EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。1000 g 离心 3 0 分钟收集样本。即刻检测,或者 分装,-20℃以下贮存。 本试剂盒可能适用于其它生物学样本。

细胞培养上清、血清和血浆已经过验证。

 

注意:检测前,样本中可见的沉淀必须去除。不要使用严重溶血或高血脂的样本。 样本应分装并贮存于-20℃,以避免人IL-6活性的丢失。如果在 24 小时内检测,样本可以 存放在 2 - 8℃。 避免样本的反复冻融。在检测前,冷冻样本应该缓慢地恢复至室温,轻柔地混匀。


【检验方法】

试剂准备

检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温。 如果浓缩的试剂出现结晶,37℃温浴,直至结晶全部溶解。

1×洗液

吸取 20×浓缩洗液 30 ml  1 L 的量筒,加蒸馏水或去离子水至600 ml,轻轻混匀,避免泡 沫。 转移至干净瓶内。2 - 25℃贮存,1×洗液可稳定 30 天。

1×检测缓冲液

 吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml  100 ml 量筒,加蒸馏水或去离子水至 50 ml,轻轻混匀,避 免泡沫。 2 - 8℃贮存,1×检测缓冲液可稳定保存 30 天。

检测抗体 稀释前充分混匀。根据标准品和待测样本的数量,用 1×检测缓冲液按 1100 稀释浓缩的检 测抗体。 注意:请在 30 分钟内使用稀释后的检测抗体。

 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素

稀释前充分混匀。 根据标准品和待测样本的数量,用 1×检测缓冲液按 1100 稀释浓缩的辣根过氧化物酶标记的 链霉亲和素。 注意:请在 30 分钟内使用稀释后的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

样本稀释

如果样本需要稀释,请用试剂盒提供的 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本,用细胞培养基稀释 细胞培养上清。

白细胞介素6 (IL-6)标准品

用蒸馏水或去离子水重溶白细胞介素6 (IL-6)标准品,重溶体积标注在白细胞介素6 (IL-6)标准品的标签上。轻柔 地涡旋震荡,确保充分混匀,重溶后标准品的浓度为4000 pg/ml。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释 前充分混匀。 请使用聚丙烯管进行标准品稀释。

标准曲线制作血清/血浆样本标准曲线的制作:

 250 μ浓缩的白细胞介素6 (IL-6)标准品,加入 250 μ标准品稀释液,作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μ标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1系列稀释。每次移 液时,请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。

细胞培养上清样本标准曲线的制作:

 250 μ浓缩的白细胞介素6 (IL-6)标准品,加入 250 μ细胞培养基,作为标准曲线的最高浓度 (2000 pg/ml)。在每一个试管中加入 250 μ细胞培养基。使用高浓度标准品做 1系列稀释。每次移液 时,确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓



【检测步骤】

检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。

1. 准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。

2.将不需要的板条拆卸下来,放回装有干燥剂的铝箔袋,重新封好封口。

3.加入300 μl1×洗液静置浸泡30秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后,在吸水纸上将微孔板拍干。洗板完成之后,请立即使用微孔板,不要让微孔板干燥。

4.每孔加入50 μl1×检测缓冲液。

5. 复孔加入50 μl 2倍倍比稀释的标准品,空白孔复孔加入50 μl标准品稀释液。样本孔加入50 μl样本。

6. 每孔加入50 μl稀释的检测抗体。保证步骤456连续加样,不要间断。加样过程在15分钟内完成。

7. 使用封板膜封板。300/分钟振荡,室温孵育2小时。

8.弃掉液体,每孔加入300 μl洗液洗板,洗涤6次。每次洗板,在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能,必须彻底移除残留液体。

9.每孔加入100 μl稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。

10. 使用新的封板膜封板。300/分钟振荡,室温孵育45分钟。

11. 重复步骤8

12. 每孔加入100 μl显色底物TMB,避光,室温孵育5 -30分钟。

13. 每孔加入100 μl终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻叩击板框,充分混匀。

14. 在30分钟之内,使用酶标仪进行双波长检测,测定450 nm最大吸收波长和570 nm630 nm参考波长下的OD值。校准后的OD值为450 nm的测定值减去570 nm630 nm的测定值。仅使用450 nm测定会导致OD值偏高,并且准确度降低。

【结果计算】

计算标准品和样本的平均OD值,然后减去零浓度标准品的OD值。

以标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标,用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。回归分析确定最佳拟合曲线。通过对浓度值和OD值取对数拟合,可以对标准曲线进行线性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度,但数据的准确度会降低一些。

注意:标准曲线最高浓度点的终浓度为500 pg/ml。如果完全按照说明书的步骤操作(50 μl样本+ 50μl检测缓冲液),计算样本浓度时请乘以稀释因子2

如果样本按照说明书进行了稀释,最终的稀释倍数为2。如果样本进行了其它方式的稀释,计算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。

【检验方法的局限性】

1、仅供科研使用,不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的有效期内使用,过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于最高标准品浓度值,请将样本适当稀释后,再重新测定。

6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果,检测前,请排除该因素。

7、通过其他方法得到的检测结果,与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。


【产品性能指标】

1、物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装,无破损漏气。

2、剂量反应曲线线性

校准品剂量反应曲线相关系数r值,大于等于0.9900

3、精密度

批内精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%

批间精密度:三组已知的高、中、低浓度样品,进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%

4、检测范围

78.1pg/ml→500pg/ml

5、灵敏度

最低检出剂量小于0.37pg/mL。

6、回收率

三组已知的高、中、低浓度样品,进行五次回收率评估,回收率在85%-115%之间。

7、特异性

本试剂盒识别天然和重组白细胞介素6 (IL-6),与结构类似物无交叉。

8、稳定性

    2-8℃保存,有效期6个月。


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